Sekvenováni nové generace (NGS)
Sekvenování nové generace (Next-Generation Sequencing, NGS), známé též jako masivně paralelní sekvenování (MPS), je vysoce citlivá a propustná metoda, která umožňuje rychlé sekvenování bází v molekulách DNA nebo RNA. Na rozdíl od tradičního Sangerova sekvenování, NGS technologie využívá paralelního sekvenování milionů různých molekul DNA, což umožňuje provádět komplexní analýzu genomu v mnohem kratším čase. V současnosti je technologie NGS využívána jak vědeckou, tak i lékařskou komunitou k odhalování genetické informace s unikátní rychlostí a přesností, čímž přináší významné pokroky do výzkumu, diagnostiky a personalizované medicíny.
První klinické aplikace NGS se začaly objevovat kolem roku 2008. Krátce poté následovala rychlá adaptace a validace této metodiky pro diagnostické účely. Do roku 2013 získalo NGS významné postavení v klinické diagnostice, a to zejména v oblastech dědičných chorob a onkologie. Pokroky v technologii, snížení nákladů na sekvenování a vývoj robustních bioinformatických nástrojů usnadnily jeho integraci do běžné klinické praxe. V důsledku rychlého vývoje a implementace NGS do rutinní praxe lze dnes považovat tuto metoda za dostupný a spolehlivý nástroj pro genetické testování.
V kontextu diagnostiky dědičných onemocnění NGS umožňuje identifikaci zárodečných mutací v široké škále genů, což usnadňuje screening život ohrožujících nemocí, jako je cystická fibróza, svalová dystrofie a různé dědičné druhy rakoviny již krátce po narození dítěte. Sekvenováním genů, které jsou známé svou souvislostí s rozvojem konkrétních poruch, mohou lékaři přesně určit genetický základ zodpovědný za pacientův stav, což vede k přesnější diagnostice a personalizovaným léčebným postupům, které mohou výrazně zlepšit prognózu nebo zcela předejít rozvoji onemocnění.
V onkologii se naopak NGS využívá k detekci somatických mutací, genetických změn v buňkách získaných v průběhu života, které vedou k rozvoji nádorů. Výsledkem analýzy tumorové DNA prostřednictvím NGS je detailní molekulární profil rakoviny, na základě kterého lze identifikovat cíle pro terapii a vývoj přizpůsobených léčebných postupů. NGS dokáže například identifikovat mutace v genu EGFR u rakoviny plic, což usměrňuje použití specifických inhibitorů, které na tyto změny cílí. Navíc je NGS klíčová pro monitorování minimální zbytkové nemoci a sledování evoluce rakoviny, což zlepšuje prognózu a léčebné strategie.
NGS také hraje zásadní roli v detekci a monitorování infekčních nemocí. Poskytováním kompletních dat ve vysokém rozlišení o genetickém materiálu patogenů umožňuje NGS rychlou identifikaci bakterií, virů, hub a dalších mikroorganismů přítomných v klinických a environmentálních vzorcích. Tato technologie umožňuje detekci nových a nastupujících patogenů, genů rezistence na antimikrobiální látky a virulenčních faktorů, což zlepšuje naše chápání biologie a epidemiologie patogenů. NGS může být obzvláště cenné v situacích propuknutí regionálních ohnisek nákazy, kde usnadňuje sledování přenosu a evoluce patogenů v reálném čase. Sekvenováním genomů patogenů z různých pacientů nebo environmentálních vzorků může NGS monitorovat šíření infekce a identifikovat zdroje kontaminace, což napomáhá při implementaci účinných opatření pro kontrolu infekcí a zmírňování dopadů epidemie
Sekvenování krátkým čtením (SR-Seq)
Sekvenování krátkým čtením (short-read sequencing, SR-Seq) je NGS metoda analýzy DNA molekul různého původu, která zahrnuje současné čtení milionů až miliard krátkých úseků DNA, obvykle v rozmezí od 50 do 300 párů bází. Samotnému procesu SR-Seq předchází příprava DNA knihovny, během níž je původní DNA molekula rozštěpena na krátké fragmenty. Následně jsou na tyto krátké úseky DNA připojeny molekulární adaptéry, přičemž je knihovna obvykle amplifikována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Připravená knihovna je poté nanesena na průtokový čip, na kterém se fragmenty fyzicky přichytí a každý z nich může být sekvenován. Nejrozšířenější technologií pro sekvenování DNA krátkými úseky je metoda sekvenování syntézou (SBS), využívaná například na přístrojích společnosti Illumina, při níž jsou na krátké fragmenty DNA postupně přidávány fluorescenčně označené nukleotidy a jejich začlenění je detekováno kamerou. Zpětné sestavení sekvence, která byla v původní molekule DNA před její štěpením, je umožněno zarovnáním krátkých úseků vůči referenčnímu genomu. Pro identifikaci genetických změn v osekvenovaných molekulách DNA se využívají sofistikované bioinformatické nástroje, které sekvenační data analyzují.
Ve srovnání s klasickými metodami sekvenování, jako je Sangerovo sekvenování, nabízí SR-Seq několik výhod. Jednou z nejvýznamnějších výhod této metody, a obecně jakékoliv jiné NGS technologie, je její vysoká propustnost. Zatímco Sangerovo sekvenování může pročíst pouze jeden krátký úsek DNA, SR-Seq dokáže sekvenovat miliardy úseků současně, čímž generují obrovské množství dat v mnohem kratší době. NGS je tak zvláště vhodným nástrojem pro rozsáhlé genomické projekty a populační studie. Další výhodou sekvenování na principu NGS je jeho cena. V přepočtu na jednu bázi je sekvenování pomocí NGS výrazně nižší než u Sangerova sekvenování, což ho činí dostupnějším pro širokou škálu výzkumných a klinických aplikací. Pokročilé NGS technologie také poskytují velmi vysokou přesnost a nízkou chybovost. To zajišťuje, že generovaná data jsou spolehlivá a mohou být použita pro podrobnou genetickou analýzu a diagnostiku. SR-Seq je navíc z pohledu využitelnosti pro různé typy aplikací vysoce univerzální metodou, jelikož umožňuje sekvenování celého genomu, cílené sekvenování genů, sekvenování RNA, mikrobiomu a dalších. V kontextu klinické diagnostiky umožňuje cílené sekvenování vyšetřit konkrétní geny, u kterých byla prokázána spojitost s rozvojem onemocnění u více pacientů najednou.
Sekvenování dlouhým čtením (LR-Seq)
Technologie sekvenování dlouhým čtením (long-read sequencing, LR-Seq) představuje novou generaci přístupů a technologií určených k detailní a zároveň komplexní a robustní analýze DNA na báze NGS. Technologie LR-Seq přináší do procesu sekvenování DNA řadu inovací, mezi které patří zejména sekvenace jednotlivých molekul DNA v reálném čase, zrychlení a zefektivnění procesů přípravy vzorků a využití nových bioinformatických řešení při interpretaci dat. Standardní metody NGS jsou založeny, bez ohledu na typ platformy (Illumina, Ion Torrent, MGI, Elemenent Bioscience), na sekvenování krátkých fragmentů DNA (zpravidla do 300 párů bází), které umožňuje standardně detekci pouze jednonukleotidových záměn (SNPs), malých inzercí nebo delecí bází DNA (indels) a případně výskyt oblastí ztrát a zisků DNA (copy number variants – CNVs). I když techniky MPS využívající krátká čtení jsou v současné době považovány za standardní, nové vědecké objevy a problémy již delší dobu poukazují na určité limity, zejména v detekci strukturních genetických aberací a repetitivních sekvencí v genomu člověka.
Analýza genomu pomocí LR-Seq technologie je založena na izolaci vysokomolekulární DNA (uHMW DNA), která je zapotřebí jako zdrojový materiál. Díky tomu lze sekvenovat dlouhé fragmenty DNA (typicky o velikosti desítek kilobází) a získat tak bezprecedentní množství informací o genomu v rámci jednoho experimentu. K informaci o výskytu SNPs, indelů a CNVs přidává LR-Seq navíc možnost detekovat strukturní změny v DNA, fázování haplotypů (původ variant od matky versus otce) a informaci o nativní methylaci DNA (epigenetika), která má vliv na genovou expresi. Navíc je možné analyzovat i dříve problematické strukturní oblasti genomu, jako jsou centromery, telomery, konce akrocentrických chromozomů nebo oblasti trinukleotidových repetic.
Kromě přidané hodnoty v oblasti genomiky přináší LR-Seq revoluci i na poli transkriptomiky. Díky své schopnosti analyzovat RNA transkripty v celé jejich délce, umožňuje LR-Seq rozlišení rozdílných produktů stejného genu vznikajících v důsledku alternativního sestřihu, ale i detailnější identifikaci fúzních genů a přesnější charakterizaci exon-intronových rozhraní, což vede k lepšímu porozumění genové exprese a její regulace.
