Objednat vyšetření

Advanced sequencing

Sophgena a.s. poskytuje jako první v České republice služby subjektům, které mají zájem o sekvenování proteinů pomocí metody sekvenování nové generace (NGS-P) na přístroji Platinum (TM) od Quantum-Si.

Rovněž v průběhu druhého čtvrtletí zavedeme jako první v ČR služby v oblasti sekvenování dlouhým čtením na sekvenátoru REVIO od společnosti PacBio.

Sekvenování proteinů nové generace

Přístroj Platinum od společnosti Quantum-Si je úplně prvním systémem svého druhu umožňujícím sekvenování proteinů pomocí metody sekvenování nové generace (NGS-P). Na rozdíl od tradičních metod sekvenování proteinů, jakými jsou Edmanova degradace nebo hmotnostní spektrometrie, metoda NGS-P umožňuje čtení sekvence aminokyselin, základních stavebních jednotek proteinů, u milionů molekul proteinu najednou. Při použití metody NGS-P se tak zvyšuje nejen přesnost, s kterou je určeno pořadí aminokyselin v proteinu, ale i celkové množství informací, které lze získat. Příprava vzorků pro tuto metodu sekvenace navíc nevyžaduje vysoce specializovaný personál ani nákladné laboratorní vybavení, a výsledky lze prohlížet v uživatelsky srozumitelném cloudovém prostředí.

Pracovní postup přípravy vzorků spočívá jednoduše v rozštěpení proteinu na méně dlouhé peptidy, z kterých je ve sledu několika enzymatických reakcí vytvořena tzv. peptidová knihovna, obsahující milióny fragmentů původního proteinu se schopností zachytit se na povrchu sekvenačního čipu. Samotná technologie sekvenace je založena na využití takzvaných rozpoznávačů (z anj. recognizers) aminokyselin, které se vážou na konce molekul peptidů přichycených na pevném nosiči a na základě svého vazebného partnera a stabilitě vazby vysílají specifický optický signál, umožňující identifikaci první aminokyseliny v pořadí. Na jednotlivých peptidech postupně dochází k odštěpování rozeznaných aminokyselin a proces identifikace se opakuje na následující aminokyselině v sekvenci peptidu. Jelikož proces probíhá paralelně na všech navázaných peptidech, jejichž sekvence aminokyselin se vzájemně překrývají, při následné automatizované analýze dochází k zarovnání těchto sekvencí do podoby jedné molekuly. Výsledné pořadí aminokyselin v osekvenovaném proteinu se následně porovná se zvolenou referencí, což umožňuje identifikovat například potencionálně patologické varianty proteinu nebo nový funkční typ bílkoviny ve vzorku, ze kterého byla připravena peptidová knihovna. Vzhledem k vazebním vlastnostem rozpoznávačů lze navíc detekovat i některé specifické variace aminokyselin, které standardně vznikají při tvorbě proteinů v buňkách v procesech známých jako post-translační modifikace a výrazně ovlivňují výslednou funkci, lokalizaci, nebo životnost finálního proteinu. Oproti hmotnostní spektrometrii není tato metoda závislá na náboji detekovaných aminokyselin, a tak je možné studovat i proteiny, které mohou pro hmotnostní spektrometrii představovat podstatnou výzvu (např. membránové proteiny apod.)

Grafickou reprezentaci popsaného procesu sekvenace lze zhlédnout na stránkách výrobce, zde: https://www.quantum-si.com/technology/

Tato metoda sekvenace proteinů najde využití v široké škále výzkumných a komerčních aplikací, včetně:

 

  • Proteinového inženýrství: evaluace produkce proteinů z expresního systému na základě sekvenace molekulárních barkódů, ověření produktu chimérického systému na úrovni sekvence aminokyselin
  • Buněčné biologie: identifikace proteinových izoforem, přirazení sekvence proteinu k sledovanému fenotypu, ověření přítomnosti a identifikace neočekávaných proteinů ve výstupu analytických metod (např. nespecifický produkt na gelu)
  • Imunologie a výzkumu protilátek: snadná sekvenace těžkých a lehkých řetězců protilátek, možnost sekvenace cílených proteinů a potvrzení specificity protilátek
  • Genomického výzkumu: doplnění sekvence proteinu jako výsledného produktu DNA/RNA genu.
  • Výzkumu biomarkerů pro účely diagnostiky a vývoje terapeutik: reprodukovatelná a spolehlivá metoda pro získání funkčních informací o proteinech, které lze využít k vývoji a nastavení cílené terapie. Možnost screeningu vhodných kandidátů na vakcíny za využití peptidových barkódů.
  • Výroby protilátek: nenákladné ověření specificity protilátek, které může vést k širší a kvalitnější nabídce. Doplnění sekvence aminokyselin jako validační kritérium protilátky a zisk konkurenční výhody. Potvrzení specificity protilátky osekvenováním vázaných proteinů.

Sekvenování dlouhým čtením – nové možnosti pro analýzu genetické informace

Technologie sekvenování dlouhým čtením („long read sequnecing“ = LR-seq) představuje novou generaci přístupů a technologií určených k detailní a zároveň komplexní a robustní analýze DNA. Technologie LR-seq přináší do procesu sekvenování DNA řadu inovací, mezi které patří zejména sekvenace jednotlivých molekul DNA v reálném čase, zrychlení a zefektivnění procesů přípravy vzorků a využití nových bioinformatických řešení při interpretaci dat. Standardní metodiky masivního paralelního sekvenování (MPS)v jsou založeny bez ohledu na typ platformy (Illumina, Ion Torrent), na sekvenování krátkých fragmentů DNA (max 300 párů bazí), které umožnuje standardně detekci pouze jednonukleotidových záměn (SNPs, malých inzercí nebo delecí bází DNA (indels) a případně výskyt oblastí ztrát a zisků DNA (copy number variants – CNVs). I když je technika MPS v současné době považována za standardní, nové vědecké objevy a problémy již delším dobu poukazují na určité limitace zejména v detekci strukturních genetických aberací a repetitivních sekvencí v genomu člověka.
LR-seq technologie je založena na izolaci vysokomolekulární DNA ( uHMW DNA ), která je zaptřebí jako zdrojový materiál pro analýzu. Díky tomu lze sekvenovat dlouhé fragmenty DNA (typicky desítky kilobází) a získat tak bezprecedentní množství informací o genomu v rámci jednoho experimentu. K informaci o výskytu SNPs, indelů a CNVs přidává LR-seq navíc detekci strukturních změn v DNA, fázování haplotypů (původ variant z mateřského/otcovského genomu), a informaci o nativní methylaci DNA (epigenetika). Navíc je možné analyzovat i dříve problematické oblasti v genomu, jako jsou centromery, telomery, akrocentrické konce chromozomů nebo oblasti trinukloetidových repetic. Sophgena a.s. jako první laboratoř v ČR využívá pro LR-seq analýzy vlastní sekvenátor Revio od společnosti PacBio. Systém Revio je nový revoluční systém sekvenování s dlouhým čtením a vysokou kapacitou a v současné době představuje „state of the art“ sekvenační platformu na trhu.

Vezměte osud a Vaše zdraví
do vlastních rukou